La película comienza en un hospital de Tokio. Yuichi Kimura/"El Padre" (Andrew Koji) está junto a la cama de su hijo Wataru (Kevin Akiyoshi Ching), que fue empujado desde un tejado mientras su padre estaba ausente. El padre de Yuichi, "El Anciano" (Hiroyuki Sanada), llega y le recuerda a su hijo que los padres deben proteger a sus familias. Yuichi sale a buscar a quien haya hecho daño a su hijo.

Un asesino llamado Ladybug (Brad Pitt) vuelve al trabajo tras una excedencia. Considera que el nombre es irónico, ya que no cree que tenga la suerte que suelen tener las mariquitas. También sustituye a otro asesino, Carver, que está enfermo. Ladybug habla con su encargada, Maria Beetle (Sandra Bullock), que le asigna subir a un tren bala que va de Tokio a Kioto. Su tarea consiste en recuperar un maletín que contiene dinero con una pegatina del tren en el asa. Mientras se dirige hacia allí, Ladybug se tropieza con Yuichi, lo que hace que se le caiga la llave de una taquilla y su billete de tren. Ladybug entra en la taquilla y encuentra allí una pistola, pero se niega a cogerla, a pesar de la insistencia de María.

A bordo del tren están los hermanos asesinos "gemelos", Tangerine (Aaron Taylor-Johnson) y Lemon (Brian Tyree Henry). Han sido enviados por un jefe del crimen conocido como "La Muerte Blanca" (Michael Shannon) para recuperar a su hijo (Logan Lerman), ya que es un drogadicto en el que no se puede confiar por su cuenta. Lemon vive gran parte de su filosofía basándose en "Thomas The Tank Engine", y relaciona a ciertas personas con personajes del programa. Tangerine le explica a Lemon cómo Muerte Blanca era un vagabundo ruso que acabó trabajando como mano derecha de un jefe de la Yakuza llamado Minegishi (Nobuaki Shimamoto), hasta que acabó formando su propia banda y traicionando a Minegishi y matándolo. Mientras hacen compañía al Hijo, los hermanos discuten sobre cuántas personas han matado en total (una de ellas era un transeúnte inocente en el lugar y el momento equivocados).

Yuichi sube al tren tras encontrar una pista sobre quién empujó a Wataru. Es aturdido por una asesina llamada "El Príncipe" (Joey King), que se hace pasar por una inocente colegiala para despistar a la gente sobre su verdadera naturaleza. Cuando se despierta, le dice que empujó a Wataru para atraer a Yuichi hacia ella, ya que fue él quien proporcionó a Lemon y Tangerine el maletín. Quiere la ayuda de Yuichi para amañar el maletín y dárselo a la Muerte Blanca para que lo mate. Además, Prince ha manipulado una pistola para que le explote la cabeza al apretar el gatillo. Para obligar a Yuichi a cooperar, Prince le dice que tiene un secuaz en el hospital dispuesto a matar a Wataru si no tiene noticias suyas.

Ladybug recupera el maletín pero el revisor (Masi Oka) le dice que tiene que bajarse en la primera parada porque no llevaba el billete. Antes de salir, le encuentra otro asesino conocido como "El Lobo" (Bad Bunny). Un flashback muestra a Wolf ascendiendo en el cártel a las órdenes de un jefe llamado El Saguaro (Julio Gabay) y luego encontrando una esposa (Andrea Muñoz). Sin embargo, todos los asistentes a la boda de Wolf fueron envenenados, incluidos El Saguaro y la esposa de Wolf. Éste cree que Mariquita es la responsable de sus muertes, e intenta matarlo. Los dos luchan en el coche bar antes de que el cuchillo de Wolf rebote en el maletín y se clave en su corazón, matándolo. Ladybug cubre las heridas de Wolf y llama a María. Ella le informa de que fue camarero en la boda de Wolf, y que el tequila que se sirvió allí estaba envenenado con una serpiente boomslang, que fue robada de un zoo de Tokio y que se encuentra en el tren.

Lemon y Tangerine descubren que el maletín ha desaparecido y que el Hijo también ha muerto envenenado. Le cubren la cara y le limpian la sangre antes de ir a buscar a Ladybug. Ladybug se encuentra con Lemon en el coche silencioso y lo reconoce de un trabajo en Johannesburgo. Se pelean y Ladybug intenta desarmar a Lemon. Al final, Ladybug noquea a Lemon y le pincha la botella de agua con polvos para dormir. Ladybug cambia entonces de ropa con otro pasajero (Channing Tatum) y vuelve a hablar con María. Ella le dice que otro asesino, "The Hornet" (Zazie Beetz), fue contratado por Muerte Blanca y está en el tren. Mientras tanto, Tangerine tiene que bajarse en la siguiente parada brevemente para reunirse con los matones de Muerte Blanca para asegurarles que el trabajo va según el plan.

Tangerine encuentra a Ladybug y lucha contra él, creyendo que Ladybug envenenó al hijo de Muerte Blanca. Ladybug abre una puerta de emergencia y hace que los dos casi salgan volando del tren antes de volver a entrar. La Muerte Blanca se pone en contacto con Tangerine para hacerle saber que si no aparecen con el Hijo y el maletín, matará a todos los que están en el tren. Los dos intentan engañar a los hombres de la Muerte Blanca haciéndose pasar por hermanos y utilizando un maletín diferente, pero Ladybug lo abre accidentalmente y les hace perder su tapadera, obligándoles a correr de nuevo hacia el tren. Ladybug echa a Tangerine del tren antes de que éste se ponga en marcha de nuevo, pero consigue volver a subir a bordo antes de que se aleje demasiado rápido.

Lemon se encuentra con Yuichi y Prince, donde rápidamente determina que ambos no están allí con fines nobles. Lemon dispara a Yuichi, pero sabe que no debe confiar en Prince. Desgraciadamente, se ha bebido el agua con gas y acaba desmayándose. Prince dispara a Lemon en el pecho y los esconde a él y a Yuichi en el baño.

Ladybug se encuentra con Hornet, que estaba disfrazada en el tren como un personaje de anime antes de intercambiar la ropa con la chica de la concesión (Karen Fukuhara). Ella robó la serpiente boomslang del zoológico y utiliza su veneno para matar a sus víctimas, ya que el veneno congela la sangre y hace que las víctimas sangren por todos los orificios. Hornet envenena a todos los asistentes a la boda de Wolf, ya que ella también estaba allí como pastelera. Ladybug lucha contra Hornet, que está allí para cobrar su pago. Ella intenta clavarle una jeringuilla que contiene el veneno, pero él recibe un ligero pinchazo mientras le clava a ella el resto. Hornet intenta administrarle el antídoto, pero Ladybug se lo quita primero y ve cómo se arrastra para morir.

Mandarina encuentra el cuerpo de Limón en el baño e intenta ir tras su asesino. Vuelve a hablar con Muerte Blanca, que le dice que ha comprado hasta el último billete para Kioto para que sólo queden los que quedan en el tren. Tangerine se encuentra con Prince y casi se deja engañar por ella hasta que ve que Lemon dejó una pegatina del personaje Diesel de "Thomas", lo que significa que sabía que era una villana. Antes de que Tangerine pueda matar a Prince, Ladybug lo encuentra de nuevo y lucha contra él, terminando Ladybug disparando a Tangerine en el cuello, dejándolo desangrarse antes de que pueda advertir a Ladybug sobre Prince.

Ladybug intenta que Prince se baje del tren en la siguiente parada, pero lo mantiene deliberadamente dentro, engañándolo con su acto inocente. El Anciano sube entonces al tren ya que escuchó a Prince por teléfono y sabía que algo iba mal en el tren. Se sienta cerca de Ladybug y Prince hasta que Ladybug se asusta cuando la serpiente boomslang viene y le muerde. El Anciano se enfrenta a Prince, que se prepara mientras su secuaz se dispone a matar a Wataru. Sin embargo, El Anciano se preparó para esto y tenía su propio asesino haciéndose pasar por una enfermera, y ella mata al tipo de Prince antes de que pueda tocar a Wataru. Prince huye y Ladybug regresa. El Anciano le habla de cómo Ladybug piensa que tiene mala suerte, y le deja con la creencia de que todo sucede por una razón. También le cuenta la historia de cómo era el confidente original de Minegishi antes de que la Muerte Blanca los traicionara, y ha jurado vengarse de la Muerte Blanca por la muerte de su esposa.

Yuichi y Lemon se despiertan entonces, ya que Lemon llevaba un chaleco antibalas. Al ver que Mandarina está muerta, se enfurece e intenta ir a por Ladybug, pero Yuichi y El Anciano les hacen trabajar juntos mientras se preparan para enfrentarse a Muerte Blanca.

El tren llega a Kioto mientras la Muerte Blanca se prepara para subir. Prince se enfrenta a él y se revela que son padre e hija. Ella quería llamar su atención, ya que favorecía a su hijo, e intenta que se suicide con la pistola amañada, pero él simplemente se aleja de intentar matarla. Los demás se enfrentan a él fuera, mientras los matones de Muerte Blanca intentan abrir el maletín amañado. La Muerte Blanca explica entonces que todos los que estaban en ese tren estaban allí porque él lo había orquestado: ha querido vengarse de la muerte de su esposa (Johanna Watts), que murió en un accidente de coche que fue un intento de asesinato contra él. Lemon y Tangerine mataron a los hombres de Muerte Blanca en un trabajo en Bolivia, y él les proporcionó información sobre otros asesinos. Tampoco se preocupó por su hijo, ya que el intento de su mujer de sacarlo de nuevo de sus crímenes la llevó a la muerte. Hornet fue atraído allí porque envenenó al cirujano que podría haber salvado la vida de su esposa. Finalmente, cree que Ladybug es Carver (Ryan Reynolds), quien orquestó el intento de asesinato. Apostó por que todos los asesinos se mataran entre sí. El maletín explota entonces justo cuando Lemon consigue que el tren se ponga en marcha. Ladybug vuelve a subir y es perseguida por Muerte Blanca y sus matones.

El Anciano se enfrenta a Muerte Blanca en el tren mientras Ladybug y Lemon luchan contra los esbirros mientras el tren se descontrola. Mientras matan a los esbirros, Ladybug intenta accionar los frenos de emergencia. Lemon acaba lanzándose a sí mismo y al último esbirro fuera del tren mientras pasan por un puente. Antes de que Muerte Blanca pueda matar a El Anciano, Ladybug acciona los frenos y El Anciano aprovecha la oportunidad para empalar a su enemigo cerca de la muerte. El tren descarrila entonces y se estrella contra un pueblo.

Los hombres supervivientes salen del tren, y Muerte Blanca intenta ejecutar a Ladybug, pero éste agarra la pistola amañada y se vuela media cabeza. Prince intenta entonces acabar con Ladybug y los Kimuras, pero ella es atropellada por un camión de mandarinas. María llega entonces en persona para rescatar a Ladybug mientras él se separa de los Kimuras. Ha adoptado una visión positiva de la vida y cree que realmente tiene suerte... hasta que un poste de teléfono se estrella contra el coche de María, obligándoles a caminar.

Al comenzar los créditos, vemos que Lemon sobrevivió a la caída del tren y secuestró el camión de mandarinas para poder atropellar a Prince y vengar a Tangerine.