En 1991, el supersoldado con el cerebro lavado James "Bucky" Barnes es enviado desde una base de Hydra en Siberia para interceptar un automóvil que transporta una caja de suero para supersoldados. En el presente, aproximadamente un año después de que Ultrón sea derrotado por los Vengadores en la nación de Sokovia, Steve Rogers, Natasha Romanoff, Sam Wilson y Wanda Maximoff impiden que Brock Rumlow robe un arma biológica de un laboratorio en Lagos. Rumlow se hace explotar e intenta matar a Rogers. Maximoff desvía la explosión mediante telequinesis, destruyendo accidentalmente un edificio cercano y matando a varios trabajadores humanitarios de Wakanda en el proceso.

Thaddeus Ross, el Secretario de Estado de los Estados Unidos, informa a los Vengadores de que las Naciones Unidas (ONU) se están preparando para aprobar los Acuerdos de Sokovia, que establecerán un panel de la ONU para supervisar y controlar al equipo. Los Vengadores están divididos: Tony Stark apoya la supervisión debido a su papel en la creación de Ultrón y la devastación de Sokovia, mientras que Rogers tiene más fe en su propio juicio que en el de los políticos. Mientras tanto, Helmut Zemo rastrea y mata al antiguo controlador de Barnes en Hydra, robando un libro que contiene las palabras desencadenantes que activan el lavado de cerebro de Barnes. En una conferencia de la ONU en Viena, donde se van a ratificar los Acuerdos, una bomba mata al rey T'Chaka de Wakanda. Las imágenes de seguridad indican que el terrorista es Barnes, a quien el hijo de T'Chaka, T'Challa, jura matar. Informado por Sharon Carter del paradero de Barnes y de las intenciones de las autoridades de matarlo, Rogers decide intentar traer él mismo a Barnes, su amigo de la infancia y compañero de guerra. Rogers y Wilson rastrean a Barnes hasta Bucarest e intentan protegerlo de T'Challa y las autoridades, pero los cuatro, incluido T'Challa, son detenidos por la policía de Bucarest y James Rhodes.

Haciéndose pasar por un psiquiatra enviado a entrevistar a Barnes, Zemo recita las palabras para activar el lavado de cerebro de Barnes. Interroga a Barnes y luego lo manda a la carga para cubrir su propia huida. Rogers detiene a Barnes y lo escapa. Cuando Barnes recupera sus sentidos, le explica que Zemo es el verdadero terrorista de Viena y que quería la ubicación de la base siberiana de Hydra, donde otros "Soldados de Invierno" con el cerebro lavado se mantienen en estasis criogénica. No dispuestos a esperar a que se les autorice a detener a Zemo, Rogers y Wilson se rebelan y reclutan a Maximoff, Clint Barton y Scott Lang para su causa. Con el permiso de Ross, Stark reúne un equipo compuesto por Romanoff, T'Challa, Rhodes, Visión y Peter Parker para capturar a los renegados. El equipo de Stark intercepta al grupo de Rogers en el aeropuerto de Leipzig/Halle, donde luchan hasta que Romanoff permite que Rogers y Barnes escapen. Mientras Rogers y Barnes escapan, Rhodes es derribado sin querer por Visión, y queda parcialmente paralizado. El resto del equipo de Rogers es capturado y detenido en la prisión de la Balsa, y Romanoff se exilia.

Stark descubre pruebas de que Barnes fue incriminado por Zemo y convence a Wilson para que le dé el destino de Rogers. Sin informar a Ross, Stark acude a las instalaciones de Hydra en Siberia y establece una tregua con Rogers y Barnes, sin saber que eran seguidos en secreto por T'Challa. Descubren que los otros supersoldados han sido asesinados por Zemo, quien entonces les muestra unas imágenes que revelan que en el automóvil que Barnes había interceptado en 1991 estaban los padres de Stark, a los que Barnes mató posteriormente. Enfurecido por el hecho de que Rogers le haya ocultado esto, Stark se vuelve contra ambos, lo que lleva a una intensa pelea en la que Stark destruye el brazo robótico de Barnes y Rogers desactiva la armadura de Stark. Rogers se marcha con Barnes, dejando atrás su escudo. Satisfecho por haber vengado la muerte de su familia en Sokovia por las acciones de los Vengadores, al conseguir fracturarlos, Zemo intenta suicidarse, pero es detenido por T'Challa y llevado a las autoridades.

Tras ello, Stark dota a Rhodes de unas abrazaderas exoesqueléticas para las piernas que le permiten volver a caminar, mientras Rogers saca a sus aliados de la Balsa. En una escena a mitad de los créditos, Barnes, al que se le ha concedido asilo en Wakanda, opta por volver al sueño criogénico hasta que se encuentre una cura para su lavado de cerebro. En una escena post-créditos, Parker explora las características de los tiradores de red construidos para él por Stark.