Dos años después de la Batalla de Nueva York, Steve Rogers trabaja en Washington, D.C., para la agencia de espionaje S.H.I.E.L.D., mientras se adapta a la sociedad contemporánea. Durante una misión junto a la agente Natasha Romanoff y el equipo antiterrorista S.T.R.I.K.E., liderado por el agente Brock Rumlow, para liberar a los rehenes a bordo de un barco de S.H.I.E.L.D. de los piratas liderados por Georges Batroc, Rogers descubre que Romanoff tiene otra agenda: extraer datos de los ordenadores del barco. De vuelta al Triskelion, el cuartel general de S.H.I.E.L.D., Rogers se enfrenta al director Nick Fury y recibe información sobre el Proyecto Insight: tres Helitransportes conectados a satélites espías, diseñados para eliminar amenazas de forma preventiva. Al no poder descifrar los datos de Romanoff, Furia empieza a sospechar de Insight y pide al alto funcionario de S.H.I.E.L.D. y Secretario de Seguridad Interna Alexander Pierce que retrase el proyecto.

De camino a su cita con Maria Hill, Furia es emboscado por unos asaltantes dirigidos por un asesino llamado el Soldado de Invierno. Escapando al apartamento de Rogers, Furia le advierte de que S.H.I.E.L.D. está comprometido, pero es herido por el Soldado de Invierno, antes de entregar a Rogers una unidad flash que contiene los datos de la nave. Furia es declarado muerto durante la cirugía, y Hill recupera el cuerpo. Al día siguiente, Pierce convoca a Rogers al Triskelion. Cuando Rogers le oculta la información de Furia, Pierce lo tacha de fugitivo. Perseguido por S.T.R.I.K.E., Rogers se reúne con Romanoff. Utilizando los datos, descubren un búnker secreto de S.H.I.E.L.D. en Nueva Jersey, donde activan un superordenador que contiene la conciencia preservada de Arnim Zola. Zola les informa de que, tras ser capturado por Rogers durante la Segunda Guerra Mundial, fue reclutado por S.H.I.E.L.D., donde creó una nueva Hydra más altruista que ha operado entre sus filas, sembrando el caos global con el objetivo de que la humanidad renuncie a su libertad a cambio de seguridad, utilizando al Soldado de Invierno como su principal asesino. La pareja escapa por poco de la muerte cuando un misil de S.H.I.E.L.D. destruye el búnker, y se dan cuenta de que Pierce es el líder de Hydra dentro de S.H.I.E.L.D.

Rogers y Romanoff consiguen la ayuda del empleado de la Administración de Veteranos y antiguo paracaidista de la USAF, Sam Wilson, del que Rogers se ha hecho amigo, y adquieren su mochila de alas "Halcón". Capturan al agente de S.H.I.E.L.D. Jasper Sitwell, un topo de Hydra, y le obligan a revelar que Zola ha desarrollado un algoritmo de extracción de datos que puede identificar a los individuos que se convierten en una amenaza para Hydra. Los Helicarriers Insight barrerán el mundo, utilizando armas guiadas por satélite para eliminarlos. Sitwell es asesinado en una emboscada por el Soldado de Invierno, al que Rogers reconoce como Bucky Barnes, su mejor amigo de toda la vida, al que se creía muerto; había sobrevivido a su anterior caída debido a la experimentación de Zola, y se le ha lavado el cerebro repetidamente y se le ha congelado criogénicamente para que realice las misiones de Hydra. Hill consigue llevar al trío a un piso franco donde Furia, que había fingido su muerte, planea sabotear los Helicarriers sustituyendo sus chips de control.

Tras la llegada de los miembros del Consejo de Seguridad Mundial para el lanzamiento de los Helitransportes, Rogers transmite el complot de Hydra a todos los presentes en el Triskelion. Romanoff, disfrazado de uno de los miembros del Consejo, desarma a Pierce. Furia llega y obliga a Pierce a desbloquear la base de datos de S.H.I.E.L.D. para que Romanoff pueda filtrar información clasificada, exponiendo a Hydra al público. Tras un forcejeo, Fury mata a Pierce. Rogers y Wilson asaltan dos Helicarriers y reemplazan los chips de los controladores, pero Barnes destruye el traje de Wilson y lucha contra Rogers en el tercero. Rogers se defiende de él y sustituye el último chip, lo que permite a Hill tomar el control y hacer que las naves se destruyan entre sí. Rogers se niega a luchar contra Barnes en un intento de alcanzar a su amigo, pero cuando la nave colisiona con el Triskelion, Rogers cae al río Potomac. Barnes rescata al inconsciente Rogers antes de desaparecer en el bosque. Con S.H.I.E.L.D. en desorden, Romanoff comparece ante un subcomité del Senado, mientras que Furia, amparándose en su aparente muerte, se dirige a Europa del Este en busca de las células restantes de Hydra. Rogers y Wilson deciden encontrar al Soldado de Invierno, mientras que Rumlow, que era un agente de Hydra, es hospitalizado tras la destrucción del Triskelion.

En una escena a mitad de los créditos, el Barón Wolfgang von Strucker, en un laboratorio de Hydra, proclama que la "era de los milagros" ha comenzado mientras los científicos examinan un cetro lleno de energía y dos sujetos de prueba: uno con velocidad sobrehumana y el otro con poderes telequinéticos. En una escena posterior a los créditos, Barnes visita su propio monumento en el Instituto Smithsoniano.