En 1912, un Indiana Jones adolescente descubre que un grupo de ladrones ha encontrado un crucifijo propiedad de Coronado mientras exploraba unas cuevas con su tropa de Boy Scouts en Utah. Creyendo que pertenece a un museo, Jones coge el crucifijo y evade a los ladrones para volver a casa. Sin embargo, llega el sheriff del pueblo y obliga a Jones a entregarlo al patrón del ladrón. Años más tarde, en 1938, Jones vuelve a enfrentarse al patrón frente a las costas portuguesas, recupera el crucifijo y escapa.

Tras regresar a Estados Unidos, Jones se entera de que su padre Henry ha desaparecido mientras buscaba el Santo Grial. Walter Donovan, el financiero de su padre, encarga a Jones que encuentre tanto a Henry como el Grial. Jones recibe un paquete con el diario de Henry, que incluye su investigación sobre el Grial, y viaja a Venecia junto a Marcus Brody para conocer a Elsa Schneider, socia de Henry. Bajo la biblioteca donde Henry fue visto por última vez, Jones y Schneider descubren una catacumba que contiene un escudo con una inscripción que revela que el camino hacia el Grial comienza en İskenderun. Posteriormente, son atacados por un misterioso grupo que se revela como la Orden secreta de la Espada Cruciforme, dedicada a proteger el Grial. Tras salvar al líder del grupo, éste informa a Jones de que Enrique está retenido en un castillo de Austria. Jones confía a Marcus un mapa del diario en el que se detalla una ruta hacia el Grial y le envía a İskenderun para que se reúna con su viejo amigo Sallah. Al descubrir que sus habitaciones han sido saqueadas, Jones revela la existencia del diario a Schneider antes de que duerman juntos.

En Austria, Jones y Schneider se infiltran en el castillo y descubren que está bajo control nazi. Jones encuentra a Henry e intenta escapar, pero se rinde después de que Schneider quede cautiva de los nazis. Ésta se revela como colaboradora nazi, y Jones y Henry son atados y se enteran de que Donovan también colabora con los nazis. Tras llegar a Iskenderun, Marcus también es capturado por los nazis. Schneider regresa a Alemania, mientras Jones y Henry escapan del castillo antes de viajar a Berlín para recuperar el diario. Tras recuperarlo de manos de Schneider, Jones y Henry huyen en un zepelín antes de evadir dos aviones de la Luftwaffe que les perseguían.

Al llegar a Hatay, Sallah revela a Jones y Henry que los nazis también han viajado hasta allí utilizando el mapa. Mientras siguen el rastro, los nazis son atacados por la Orden pero los derrotan. Henry aprovecha la distracción para intentar rescatar a Marcus, pero es capturado; Jones ataca el convoy nazi en respuesta y finalmente consigue destruirlo con ayuda de Henry y Marcus. Jones, Henry, Marcus y Sallah se dirigen a un templo que contiene el Grial, donde observan a los nazis intentando superar las trampas del templo antes de ser capturados. Donovan obliga a Jones a encontrar un camino para ellos hiriendo mortalmente a Henry. Con la ayuda del diario, Jones supera las trampas y encuentra una sala con cientos de copas y un antiguo caballero, que le explica que sólo una copa es el verdadero Grial. Donovan entra en la habitación, muriendo al beber de la copa equivocada, antes de que Jones identifique el verdadero Grial y salve a Henry. Schneider cae al vacío cuando intenta marcharse con el Grial, provocando el derrumbamiento del templo. Jones y sus compañeros consiguen escapar, cabalgando hacia la puesta de sol.