La película comienza en las calles de Nueva York, donde agentes de TCRI (Techno Cosmic Research Institute) buscan al loco científico Baxter Stockman (Giancarlo Esposito), quien ha creado su propio mutante. Por órdenes de la CEO Cynthia Utrom (Maya Rudolph), los agentes deben desmutar su creación y llevarla para sus propios experimentos.

Los agentes encuentran a Baxter en su casa después de que ha perfeccionado su suero mutágeno, y él está hablando con su primera creación, una mosca mutada. Los hombres irrumpen, y la mosca procede a eliminar a los agentes. Uno de ellos enciende un cartucho químico, causando una explosión que mata a Baxter. Sin que los agentes sobrevivientes y Utrom lo sepan, el mutágeno de Baxter ha caído en las alcantarillas.

15 años después

15 años después, las Tortugas Ninja Mutantes Adolescentes - Leonardo (Nicholas Cantu), Donatello (Micah Abbey), Michelangelo (Shamon Brown Jr) y Raphael (Brady Noon) - recorren los tejados mientras van en una misión... para conseguir víveres sin ser vistos. Usan sus habilidades ninja para entrar y salir sin ser detectados, pero deciden detenerse en el parque para una proyección al aire libre de "Ferris Bueller's Day Off". Mientras los hermanos se divierten, anhelan ser parte del mundo más allá de sus alcantarillas y con la gente de Nueva York.

Los chicos regresan a las alcantarillas tratando de entrar sigilosamente, pero son descubiertos por el Maestro Splinter (Jackie Chan) llegando más tarde de lo que dijeron que lo harían. Leo deja escapar que querían ver una película, así que Splinter comienza a recordarles por qué no van al mundo exterior.

Historia de Splinter

Comienza con su historia de cómo era una rata ordinaria que no recibía respeto en ningún lugar, especialmente de los humanos. Encontró a las tortugas en las alcantarillas después de que tocaron el mutágeno, y él también terminó mutando en una criatura humanoide. Vio que los chicos estaban fascinados con la ciudad, así que Splinter intentó llevarlos afuera hasta que los humanos comenzaron a reaccionar con horror y disgusto hacia ellos, obligando a Splinter a regresar a las alcantarillas y mantener a salvo a sus hijos. Aprendió habilidades de ninjitsu y se las pasó a los chicos para que aprendieran a estar seguros. Sin embargo, las Tortugas desean ir a la escuela secundaria y hacer amigos de su edad.

Encuentro con Superfly

En las calles, un grupo de criminales que trabajan para el misterioso Superfly (Ice Cube) roba un recipiente de mutágeno de un camión de TCRI. Después de una persecución con la policía, Superfly aparece y se lleva el camión. Luego parece matar a los criminales antes de llevarse el mutágeno.

Mientras están en los tejados jugando con sus armas, los chicos ven a una chica en su scooter, April O'Neil (Ayo Edebiri), y Leo se enamora instantáneamente de ella. Ella les grita por casi golpearla con una estrella ninja hasta que ven que su scooter está siendo robado. A pesar de las protestas de sus hermanos, Leo persigue al criminal.

Confrontación en el almacén

Las Tortugas son llevadas a un almacén donde una banda entera de matones guarda bienes robados. La banda intenta matar a las Tortugas, pero ellas usan sus habilidades de combate para vencerlos a todos. April aparece para recuperar su scooter, y mientras las Tortugas intentan esconderse, ella las ve y descubre que son mutantes. Aunque al principio está asustada, les invita a pizza y las entrevista sobre sus orígenes. Luego les muestra sus investigaciones sobre Superfly y sus actividades criminales, pero nadie ha podido encontrarlo. April da a los chicos su número para contactarla si quieren ayudarla a atrapar a Superfly y romper la historia sobre él.

Infiltración en la escuela

Después de un tiempo, los chicos contactan a April, y ella los introduce sigilosamente en su escuela secundaria. Quiere romper una gran noticia porque está superando un incidente embarazoso en el que vomitó profusamente durante los anuncios matutinos debido a los nervios. Las Tortugas esperan que detener a Superfly las haga ser vistas como héroes a ojos del público, así que recorren tratando de encontrar pistas sobre los crímenes de Superfly.

Las Tortugas obtienen pistas sobre los principales grupos criminales de la ciudad para intentar acercarse a Superfly. Derrotan a múltiples matones hasta que se enteran de que Superfly está haciendo un trato bajo el Puente de Brooklyn esa noche. Las Tortugas infiltran la reunión mientras April escucha cerca, y se sorprenden al descubrir que Superfly es un mutante como ellos, y cuando los ve, se sorprende gratamente y da la bienvenida a las Tortugas. Les presenta a su grupo de mutantes: Bebop (Seth Rogen) y Rocksteady (John Cena), Wingnut (Natasia Demetriou), Leatherhead (Rose Byrne), Ray Fillet (Post Malone), Genghis Frog (Hannibal Burress), Mondo Gecko (Paul Rudd) y Scumbug. Superfly invita a las Tortugas a pasar el rato con ellos.

El plan de Superfly

Los mutantes van a una bolera, donde Mikey se une a Mondo por sus igualmente relajados comportamientos, mientras que Raph se une a Bebop y Rocksteady para ver quién es más fuerte. Superfly habla con las Tortugas sobre cómo consideraba a Baxter su padre y a los otros mutantes sus hermanos, ya que él cuidaba de ellos. Tuvieron su propia mala experiencia tratando de entrar en la ciudad y siendo rechazados por los humanos. Superfly luego relata su plan a las Tortugas, que es usar el mutágeno robado (que las Tortugas llaman "ooze") para crear un superarma que mutará a cada criatura en la Tierra para hacer de los mutantes la especie dominante, mientras que los humanos serán esclavizados o asesinados. Las Tortugas están comprensiblemente incómodas con el plan, y April tiene que hacer que intenten no ayudar a Superfly con su objetivo. Se ven obligados a seguir el plan cuando Superfly insinúa que los matará si se niegan a unirse.

Confrontación final

Superfly hace que Leatherhead, Wingnut y Rocksteady conduzcan con las Tortugas a su destino. Los chicos idean un plan y usan el bastón bo de Donnie para golpear el gas lo suficientemente fuerte como para enviar a los otros mutantes volando a través del parabrisas, para que las Tortugas puedan robar su furgoneta. Los mutantes los siguen y April, con Superfly irrumpiendo y golpeando a las Tortugas antes de conseguir el mutágeno. Mientras los chicos intentan detenerlo, fracasan y son aprehendidos por los matones de TCRI, mientras April corre a buscar ayuda de Splinter.

Los chicos son capturados por Utrom, quien procede a "ordeñarlos" para su ADN en un intento de crear sus propios supermutantes. Mikey y Raph se debilitan hasta que Splinter llega y procede a derrotar a los matones de TCRI y a noquear a los matones de Utrom. Antes de irse, Splinter se toma el tiempo para reprender a sus hijos por desobedecerlo y casi morir, diciendo que deben escucharlo y nunca salir de las alcantarillas si quieren sobrevivir.

Batalla en la ciudad

Los héroes encuentran el escondite de Superfly mientras él comienza a activar su arma. Las Tortugas logran convencer a los otros mutantes, quienes admiten que no quieren destruir a la humanidad para su propio beneficio. Superfly se enfurece y decide activar el arma en sí mismo, por lo que las Tortugas y los mutantes se unen para luchar contra Superfly. Cuando logran enfrentarse a él, intenta llamar a Splinter, sabiendo que él también odia a los humanos y ve esto como la única forma de que los mutantes vivan en paz. Splinter se da cuenta de que no quiere ser como Superfly y ayuda a los demás a empujarlo contra la máquina, derribándola y enviándola al río.

Desafortunadamente, el ooze se filtra en el agua, y Superfly se fusiona con criaturas submarinas para convertirse en un kaiju llamado SuperDuperFly. Se dirige a la ciudad y se fusiona con animales del zoológico para volverse más grande y fuerte antes de comenzar a aterrorizar la ciudad. Las Tortugas y los mutantes resuelven salir y luchar contra él después de que Splinter les dice que estaba equivocado sobre su visión del mundo exterior.

Conclusión y créditos

Cuando las Tortugas llegan a la ciudad, los informes de noticias afirman que son parte de una banda mutante que está atacando Manhattan, lo que les desanima ya que piensan que siempre serán vistos como monstruos. Leo luego les dice a sus hermanos que no deberían ser héroes solo para ser aceptados, sino porque es lo correcto. Luego les dice que usen sus fortalezas (Mikey improvisando, Donnie con ideas y Raph siendo grande y ruidoso) para encontrar una forma de derrotar a Superfly. Donnie dice que consigan un suero de TCRI que desmutará a Superfly lanzándolo en su espiráculo. Mientras tanto, April va a una estación de noticias mientras está bajo ataque y se toma el tiempo para decirle a todo Nueva York que las Tortugas y los mutantes son buenos chicos luchando contra un verdadero villano.

Las Tortugas intentan desmutar a Superfly, pero él las agarra con su garra y comienza a intentar aplastarlas. Splinter intenta entregar el suero pero es golpeado a varias cuadras de distancia. Luego se sorprende cuando un hombre humano ofrece ayuda, y pronto, otros neoyorquinos trabajan junto con los mutantes para entregar el suero de nuevo a las Tortugas. Mientras Superfly es golpeado con basura, las Tortugas aprovechan una oportunidad para lanzar el suero en su cuerpo, haciendo que todos los animales con los que se fusionó regresen a casa mientras él se convierte en una mosca común nuevamente. La gente de Nueva York luego aclama a las Tortugas como héroes.

Splinter permite que los otros mutantes vengan a vivir con él y los chicos en las alcantarillas, mientras él y Scumbug comienzan una relación (para el disgusto de las Tortugas). Los chicos luego se inscriben en la escuela secundaria, donde son aceptados inmediatamente, y April ahora es vista entre sus compañeros como una heroína junto con las Tortugas.

A mitad de los créditos, se muestran las vidas de las Tortugas en la escuela secundaria. Donnie comienza un club de computadoras, Raph se une al equipo de lucha, Mikey se une a una clase de improvisación, y Leo ayuda a April a investigar sobre TCRI, que ha desaparecido después del incidente de Superfly. April luego se une a las Tortugas en el baile de graduación, todos sin darse cuenta de que Utrom los está monitoreando y haciendo planes para recapturarlos, mientras mantiene al Superfly desmutado en un frasco. Luego ordena ayuda de un misterioso asesino... El Shredder.