En 2014, Peter Quill, Gamora, Drax, Rocket y Baby Groot son conocidos como los Guardianes de la Galaxia. Ayesha, líder de la raza Soberana, hace que los Guardianes protejan unas valiosas baterías de Abilisk, un monstruo interdimensional, a cambio de la hermana distanciada de Gamora, Nébula, que fue sorprendida intentando robar las baterías. Después de que Rocket robe las baterías para sí mismo, el Soberano ataca la nave de los Guardianes con una flota de drones. Una misteriosa figura destruye los drones y los Guardianes se estrellan en un planeta cercano. Allí, esta figura se revela como el padre de Quill, Ego, e invita a Quill, Gamora y Drax a su planeta natal. Rocket y Groot se quedan atrás para reparar la nave y vigilar a Nébula.

Mientras tanto, Ayesha contrata a Yondu Udonta y su tripulación, que han sido exiliados de la gran comunidad Ravager por tráfico de niños, para recapturar a los Guardianes. Capturan a Rocket, pero cuando Yondu duda en entregar a Quill, al que ha criado, su ayudante Kraglin Obfonteri cuestiona su objetividad, y su lugarteniente Taserface lidera un motín con ayuda de Nebula. Taserface encarcela a Rocket y a Yondu a bordo de la nave de este último y ejecuta a sus leales liberándolos en el vacío del espacio. Nébula se marcha a buscar y matar a Gamora, a quien culpa de las torturas que le infligió su padre, Thanos. Mientras están encarcelados, Rocket y Yondu establecen un vínculo. Groot y Kraglin, este último sin intención de iniciar el motín, liberan a Rocket y Yondu, y utilizan la flecha de Yondu para destruir la nave y su tripulación mientras escapan, pero Taserface advierte al Soberano antes de morir.

Ego, un Celestial con apariencia de dios que manipuló la materia alrededor de su conciencia para formar su planeta "hogar", explica que proyectó una apariencia humanoide para viajar por el universo y descubrir un propósito, enamorándose finalmente de Meredith, la madre de Quill. Ego contrató a Yondu para que recogiera al joven Quill tras la muerte de Meredith, pero el niño nunca fue entregado, y Ego ha estado buscándolo desde entonces. Le enseña a Quill a manipular el poder Celestial. Nébula llega al planeta de Ego e intenta matar a Gamora, pero la pareja llega a una incómoda alianza cuando descubren una caverna llena de restos esqueléticos. Ego revela a Quill que, en sus viajes, plantó en miles de mundos semillas que pueden terraformarse en nuevas extensiones de sí mismo, pero sólo el poder de dos Celestiales puede activarlas. Para ello, impregnó a innumerables mujeres y contrató a Yondu para que recogiera a los niños, pero los mató a todos cuando no pudieron acceder al poder Celestial. Al principio, bajo la influencia de Ego, Quill se defiende cuando éste revela que le dio a Meredith el tumor que la mató debido a la distracción que suponía, lo que obliga a Ego a extraer parasitariamente la energía de Quill para activar las plántulas, que comienzan a consumir todos los mundos.

Mantis, la ingenua sirviente empática de Ego, se acerca a Drax y le advierte del plan de Ego. Gamora y Nebula también se enteran del plan mientras llegan Rocket, Yondu, Groot y Kraglin. Los Guardianes reunidos viajan al cerebro de Ego en el núcleo del planeta, durante el cual Yondu revela que se quedó con Quill para librarlo del destino de la otra progenie de Ego. Mientras son atacados por los drones del Soberano (que finalmente son destruidos), Rocket fabrica una bomba con las baterías robadas, que Groot coloca en el cerebro. Quill lucha contra Ego con sus nuevos poderes celestiales para distraerlo el tiempo suficiente para que los demás Guardianes y Mantis puedan escapar. La bomba explota, matando a Ego y desintegrando el planeta. Quill pierde sus poderes celestiales poco después de la muerte de Ego. Yondu se sacrifica para salvar a Quill y muere en el vacío del espacio. Tras reconciliarse con Gamora, Nébula sigue optando por marcharse y reanudar su búsqueda para matar a Thanos en solitario. Los Guardianes celebran un funeral para Yondu, al que acuden Kraglin y decenas de naves Ravager, reconociendo el sacrificio de Yondu y aceptándolo de nuevo como Ravager. Durante el funeral, Gamora admite que ama a Peter, y se convierten en pareja.

En una serie de escenas intermedias y posteriores a los créditos, Kraglin toma la flecha telequinética y la aleta de control de Yondu; el líder de los Ravager, Stakar Ogord, se reúne con sus excompañeros; Groot se ha convertido en un adolescente; Ayesha crea un nuevo ser artificial con el que planea destruir a los Guardianes, llamándolo Adam; y un grupo de Observadores desinteresados abandona a su informante, que está hablando de sus experiencias en la Tierra.