En 1988, tras la muerte de su madre, un joven Peter Quill es secuestrado de la Tierra por un grupo de ladrones y contrabandistas alienígenas llamados los Ravagers, liderados por Yondu Udonta. En 2014, en el planeta abandonado Morag, Quill roba un misterioso orbe, pero es atacado por las fuerzas del fanático renegado kree Ronan el Acusador liderado por Korath. Aunque Quill escapa con el Orbe, Yondu descubre su robo y emite una recompensa por su captura, mientras que Ronan envía a la asesina Gamora tras el Orbe.

Cuando Quill intenta vender el Orbe en Xandar, capital del Imperio Nova, Gamora le tiende una emboscada y lo roba. Se produce una pelea que atrae a un par de cazarrecompensas: el mapache modificado genética y cibernéticamente Rocket, y el humanoide arbóreo Groot. Los oficiales de Nova Corps capturan a los cuatro y los detienen en la prisión de Kyln. Un recluso de allí, Drax el Destructor, intenta matar a Gamora debido a su asociación con el poderoso señor de la guerra intergaláctica, Thanos, y con Ronan, que mató a su familia. Quill convence a Drax de que Gamora puede llevar a Ronan hasta él, aunque Gamora revela que ha traicionado a Ronan, no queriendo dejarle usar el poder del Orbe. Al enterarse de que Gamora pretende vender el Orbe al Coleccionista Taneleer Tivan, Quill, Rocket, Groot y Drax trabajan con ella para escapar de Kyln en la nave de Quill, el Milano.

Ronan se reúne con el padre adoptivo de Gamora, Thanos, para discutir su traición. El grupo de Quill huye a Knowhere, un remoto puesto de avanzada sin ley en el espacio construido en la gigantesca cabeza cortada de un Celestial. Un Drax borracho convoca a Ronan mientras el resto del grupo se reúne con Tivan. Tivan abre el Orbe, revelando la Piedra de Poder, un objeto de inconmensurable poder que destruye a todos los seres, excepto a los más poderosos, que lo empuñan. La esclava de Tivan, Carina, se apodera de la Piedra, provocando una explosión que engulle el archivo de Tivan. Ronan llega y derrota fácilmente a Drax, mientras que los demás huyen en barco, perseguidos por los seguidores de Ronan y la hermana adoptiva de Gamora, Nebula. Nebula destruye la nave de Gamora, dejándola flotando en el espacio, y los cazas de Ronan capturan el Orbe.

Quill contacta con Yondu antes de seguir a Gamora al espacio, dándole su casco para que sobreviva; Yondu llega y recupera a la pareja. Rocket, Drax y Groot amenazan con atacar la nave de Yondu para rescatarlos, pero Quill negocia una tregua, prometiendo el Orbe a Yondu. El grupo de Quill acepta que enfrentarse a Ronan significa una muerte segura, pero que no pueden dejar que utilice la Piedra del Infinito para destruir la galaxia. En la nave insignia de Ronan, el Aster Oscuro, Ronan incrusta la Piedra en su martillo de guerra, tomando su poder para sí mismo. Se pone en contacto con Thanos, amenazando con matarlo tras destruir primero Xandar. Odiando a su padre adoptivo, Nébula se alía con Ronan.

Los Ravagers y el grupo de Quill se unen a los Nova Corps para enfrentarse a los Dark Aster en Xandar, con el grupo de Quill abriendo una brecha en el Dark Aster con el Milano. Ronan utiliza su martillo de guerra potenciado para destruir la flota de los Nova Corps. Drax mata a Korath y Gamora derrota a Nebula, que escapa, pero el grupo se ve superado por el poder de Ronan hasta que Rocket estrella una nave Ravager contra el Aster Oscuro. La nave dañada aterriza en Xandar, y Groot se sacrifica para proteger al grupo. Ronan emerge de los restos y se prepara para destruir Xandar, pero Quill lo distrae, permitiendo que Drax y Rocket destruyan el martillo de guerra de Ronan. Quill coge la Piedra liberada y, con Gamora, Drax y Rocket compartiendo su carga, la utiliza para vaporizar a Ronan.

Después, Quill engaña a Yondu para que se lleve un contenedor que supuestamente contiene la Piedra, y entrega la verdadera Piedra a los Nova Corps. Mientras los Ravagers abandonan Xandar, Yondu comenta que ha salido bien que no hayan entregado a Quill a su padre según su contrato. El grupo de Quill, ahora conocido como los Guardianes de la Galaxia, ve eliminados sus antecedentes penales, y Quill se entera de que sólo es medio humano, ya que su padre forma parte de una especie antigua y desconocida. Quill abre por fin el último regalo que recibió de su madre, una cinta de casete con sus canciones favoritas. Los Guardianes se marchan en el reconstruido Milano junto con una maceta recortada de Groot, que crece hasta convertirse en una versión bebé de él.

En una escena post-créditos, Tivan se sienta en su archivo destruido con dos de sus objetos expuestos vivos: un cosmonauta canino y un pato antropomórfico.