En 1936, el arqueólogo estadounidense Indiana Jones recupera un ídolo de oro de un templo peruano con trampas. El arqueólogo rival René Belloq lo acorrala y le roba el ídolo; Jones escapa en un hidroavión que lo espera. Tras regresar a Estados Unidos, dos agentes de inteligencia del ejército informan a Jones de que las fuerzas alemanas nazis están excavando en Tanis, Egipto, y uno de sus telegramas menciona al antiguo mentor de Jones, Abner Ravenwood. Jones deduce que los nazis buscan el Arca de la Alianza, que Adolf Hitler cree que hará invencible a su ejército. Los agentes reclutan a Jones para que recupere primero el Arca.

En un bar de Nepal, Jones se reencuentra con la hija de Ravenwood, Marion, con la que Jones tuvo una vez una relación ilícita, y se entera de que Ravenwood ha muerto. El bar se incendia durante una refriega con el agente de la Gestapo Arnold Toht, que llega para quitarle un medallón a Marion. Toht intenta recuperar el medallón de las llamas, pero sólo se quema su imagen en la mano. Jones y Marion cogen el medallón y escapan.

Al viajar a El Cairo, la pareja se encuentra con Sallah, el amigo de Jones. Sallah le revela que Belloq está ayudando a los nazis, que han fabricado una réplica incompleta del medallón a partir de las quemaduras de la mano de Toht. Los soldados y mercenarios nazis atacan a Jones y parece que Marion muere, dejando a Jones abatido. Un imán descifra el medallón para Jones, revelando que en una de las caras aparece una advertencia contra la perturbación del Arca, y en la otra las medidas correctas del "bastón de Ra", un elemento utilizado para localizar el Arca. Jones y Sallah se dan cuenta de que los nazis están excavando en el lugar equivocado, se infiltran en la excavación nazi y utilizan el medallón y el bastón de Ra de tamaño correcto para localizar el Pozo de las Almas, el lugar de descanso del Arca. Recuperan el Arca -un cofre dorado e intrincadamente decorado- pero Belloq y los nazis los descubren y se apoderan de ella. Jones y Marion, a la que Belloq mantiene cautiva, son encerrados en el pozo, pero ambos escapan y Jones captura un camión que transporta el Arca. Junto con Marion, Jones se encarga de transportar el Arca a Londres a bordo de un barco de vapor. Un submarino alemán intercepta el barco y se apodera del Arca y de Marion.

El barco se dirige a una isla del mar Egeo, donde Belloq pretende probar la potencia del Arca antes de presentársela a Hitler. En la isla, Jones tiende una emboscada al grupo nazi y amenaza con destruir el Arca, pero se rinde después de que Belloq deduzca que Jones nunca destruiría algo tan importante desde el punto de vista histórico, conjeturando también que Jones quiere saber si el poder del Arca es real. Los nazis retienen a Jones y a Marion en el lugar de las pruebas mientras Belloq abre ceremonialmente el Arca, pero sólo encuentra arena en su interior. Siguiendo las instrucciones de Jones, él y Marion cierran los ojos para evitar mirar el Arca abierta, ya que ésta libera espíritus, llamas y rayos de energía que matan a Belloq, Toht y a los nazis reunidos antes de sellarse. Jones y Marion abren los ojos y descubren que la zona está limpia de cadáveres y que les han quitado las ataduras. De vuelta a Washington, D.C., el gobierno de los Estados Unidos recompensa a Jones por haber asegurado el Arca. A pesar de la insistencia de Jones, los agentes se limitan a decir que el Arca ha sido trasladada a un lugar no revelado para que los "mejores hombres" la estudien. En un gran almacén, el Arca está embalada y almacenada entre otras innumerables cajas.