Anthony "Tick" Belrose (Hugo Weaving), que utiliza el seudónimo de Mitzi Del Bra, es un drag queen afincado en Sidney que acepta una oferta para realizar su número de drag en el Lasseters Hotel Casino Resort, gestionado por su distanciada esposa Marion, en Alice Springs, una remota ciudad del centro de Australia. Después de convencer a sus amigos y compañeros de actuación, Bernadette Bassenger (Terence Stamp), una mujer transgénero recientemente afligida, y Adam Whitely (Guy Pearce), un extravagante y odioso drag queen más joven que se hace llamar Felicia Jollygoodfellow, para que se unan a él, los tres parten para una actuación de cuatro semanas en el casino en un gran autobús turístico, que Adam bautiza como "Priscilla, Reina del Desierto".

Durante el largo viaje a través de las remotas tierras que bordean el desierto de Simpson, se encuentran con una variedad de personajes, incluyendo un grupo de simpáticos aborígenes australianos para los que actúan, las actitudes menos aceptables de la Australia rural en pueblos como Coober Pedy, y son sometidos a abusos y violencia homofóbica, incluyendo el vandalismo de su autobús con grafitis homofóbicos.

Cuando el autobús se estropea en medio del desierto, Adam se pasa todo el día repintándolo de color lavanda para tapar el vandalismo. Más tarde, el trío conoce a Bob, un mecánico de mediana edad de un pequeño pueblo del interior, que se une a ellos en su viaje después de que su mujer le abandone. Antes de llegar a Alice Springs, Tick revela que Marion es en realidad su esposa, ya que nunca se divorciaron, y que en realidad van allí como un favor para ella. Continuando su viaje, Adam casi es mutilado por una pandilla homofóbica antes de ser salvado por Bob y Bernadette. Adam se ve sacudido y Bernadette le consuela, lo que les permite llegar a un entendimiento. Del mismo modo, los demás aceptan el secreto del matrimonio de Tick y resuelven sus diferencias. Juntos, cumplen un viejo sueño de Adam, que, en el plan original, es escalar el Cañón del Rey con todos los galones.

Al llegar al hotel, se revela que Tick y Marion también tienen un hijo de ocho años, Benjamin, al que Tick no ha visto durante muchos años. Tick está nervioso por exponer a su hijo a su profesión de drag y ansioso por revelar su homosexualidad, aunque se sorprende al descubrir que Benjamin ya conoce y apoya plenamente la sexualidad y la carrera de su padre. Cuando termina su contrato en el centro turístico, Tick y Adam regresan a Sydney, llevándose a Benjamin con ellos, para que Tick pueda conocer a su hijo. Sin embargo, Bernadette decide quedarse en el resort durante un tiempo con Bob, que ha decidido trabajar en el hotel después de que ambos se hayan hecho amigos.