La película comienza en 1976. Una supervillana llamada Belle Bottom (Taraji P. Henson) corre por la ciudad mientras la Liga Antivillana la persigue, ya que ha robado un mapa. Después de derribar a los agentes de la AVL, Belle llega a su escondite en la tienda de música Criminal Records. Allí se reúne con el resto de su equipo, los 6 viciosos: Strong Hold (Danny Trejo), Nun-Chuck (Lucy Lawless), Svengeance (Dolph Lundgren), Jean-Clawed (Jean-Claude Van Damme) y su fundador, Wild Knuckles (Alan Arkin). Miran el mapa y descubren que contiene la ubicación de un artefacto conocido como la Piedra del Zodiaco, que convierte a los usuarios en poderosos animales durante el Año Nuevo chino.

Los Vicious 6 vuelan a una isla donde se encuentra la Piedra. Wild Knuckles entra en el templo y localiza la Piedra del Zodiaco, pero es atacado por pequeños guardianes de metal. Lucha contra ellos y huye del templo, sólo para encontrar más guardianes que van tras él. El resto de los 6 levanta a Knuckles, pero le arrebatan la Piedra y lo traicionan, declarando que es viejo y que el equipo necesita ser dirigido por sangre fresca. Dejan caer a Knuckles al océano y se van volando.

En otro lugar, el joven Gru (Steve Carell) tiene 11 años y sueña con ser un supervillano, lo que le hace impopular entre los otros niños que piensan que es un bicho raro. Le recogen Kevin, Bob y Stuart (todos ellos Pierre Coffin, junto con el resto de los Minions). Regresan a la casa de Gru, donde encuentra algo para él en el correo. Es un mensaje de Belle Bottom, ya que Gru había enviado una solicitud para unirse a los 6 Viciosos, ya que es su mayor fan, y Knuckles es su villano favorito (o, lo era). Belle invita a Gru a presentarse a una audición en la tienda Criminal Records. Gru está entusiasmado y cree que ha llegado su momento como supervillano. Se le ve viviendo con su insolidaria madre Marlena (Julie Andrews), así como con el resto de Minions que ha empleado como secuaces. Gru anuncia la gran noticia a los Minions, que apoyan todos a su "minijefe" (aunque no le gusta el nombre).

Nudillos Salvajes resulta estar todavía vivo, ya que vive en su casa con tres de sus propios esbirros (John DiMaggio, Kevin Michael Richardson y Jimmy O. Yang). Todavía está resentido con los Vicious 6 por haberle echado de su propio equipo, y se entera de que están haciendo audiciones para un nuevo miembro.

Al día siguiente, Gru llega a Criminal Records y conoce a un joven Dr. Nefario (Russell Brand), un aspirante a científico loco. Le muestra a Gru uno de sus nuevos inventos, una pistola que dispara una mano verde pegajosa para agarrar cosas. Nefario se la da a Gru y le muestra la entrada secreta al escondite de los 6 Viciosos. Sin embargo, cuando se reúne con ellos, lo desechan por ser un niño, ya que Jean-Clawed supuso que era un hombrecito cuando revisaron su solicitud. Mientras lo despiden, otro candidato se presenta y trata de mostrar su traje de vuelo, sólo para que su jetpack funcione mal y lo haga volar como un loco. Los Vicious 6 intentan detenerlo, lo que hace que se distraigan cuando Gru ve la Piedra del Zodiaco detrás de ellos. Utiliza el arma de Nefario y le arrebata la Piedra, pero los 6 lo atrapan y comienzan a perseguirlo. Gru se reúne con los Minions y lanza la Piedra a un Minion, Otto. Gru se aleja mientras los 6 lo persiguen. Hace que Strong Hold y Nun-Chuck se golpeen entre sí, y cuando Belle y Svengeance se enganchan a la moto de Gru, éste utiliza el cohete para sacarlos de allí. Mientras tanto, Knuckles es testigo de todo y sigue a Gru en su furgoneta.

Cuando Gru consigue volver a su casa, él y los demás Minions esperan a que Otto llegue a casa. Cuando lo hace, le entrega a Gru una roca con ojos saltones. Otto le explica que acabó sufriendo un montón de percances hasta que terminó en una fiesta de cumpleaños y le cambió al cumpleañero la Piedra por la roca mascota. Gru está furioso con Otto por su metedura de pata y despide a todos los Minions. Se va por su cuenta a buscar la Piedra, pero mientras camina por la calle, los secuaces de Knuckles lo agarran y lo meten en su furgoneta, que Kevin observa. Éste va a avisar a los demás Minions de que su mini jefe ha sido secuestrado.

Gru es llevado al escondite de Wild Knuckles. Gru está emocionado por conocer a su ídolo, pero Knuckles se enfada al ver que Gru no tiene la Piedra. Se pone en contacto con la casa de Gru para intentar conseguir un rescate de su madre, pero Kevin contesta al teléfono y Knuckles le dice que entregue la Piedra en San Francisco en un plazo de dos días o matarán a Gru.

Kevin, Stuart, Bob y Otto se dirigen a la casa del niño al que Otto le dio la Piedra. El chico les dice que se la dio a su tío (RZA), que se marcha en su moto. Otto va tras él en un triciclo y los otros tres Minions encuentran un autobús para un anuncio para volar a San Francisco. Van al aeropuerto y se hacen pasar por pilotos y una azafata para colarse en el siguiente vuelo. Kevin y Stuart intentan volar y acaban tocando todos los botones y creando un lío antes de acabar aterrizando a salvo (más o menos).

Knuckles pone a Gru en un dispositivo de tortura que es un tocadiscos que lo acerca a las hojas de sierra giratorias. Envía a sus secuaces a salir y encuentran a los Minions. Intentan atraparlos, pensando que tienen la Piedra, y acaban en Chinatown, donde una acupuntora llamada Maestra Chow (Michelle Yeoh) observa cómo los esbirros golpean a los Minions. A pesar de ser una anciana pequeña, Chow hace gala de unas impresionantes habilidades de kung fu y lucha contra los esbirros. Los Minions le piden a Chow que les enseñe sus habilidades, pero ella dice que está retirada de esa vida. Sin embargo, cuando el trío le muestra sus ojos de cachorro, ella cede.

Los esbirros abandonan a Knuckles tras su percance. Libera a Gru de la trampa y le obliga a realizar tareas. Mientras limpia su piscina llena de cocodrilos, Knuckles se cae. Gru consigue sacarlo y salvarlo, y Knuckles lo agradece. Lleva a Gru a un atraco. Van al Banco del Mal, haciéndose pasar por abuelo y nieto. Knuckles finge tener un ataque al corazón para que Gru pueda robar las llaves del Sr. Perkins (Will Arnett). Gru consigue robar la Mona Lisa, haciendo que Knuckles se sienta orgulloso.

Otto recorre muchos estados en su triciclo para alcanzar al Motero, pero lo pierde de vista. El Motorista acaba localizando a Otto y lo recoge, llevándolo a San Francisco en su moto y dándole la Piedra.

Chow entrena a los Minions en artes marciales, pero acaban haciéndose más daño que aprendiendo. Rápidamente consiguen mejorar sus habilidades, pero Chow dice que sólo han superado el entrenamiento básico. Por desgracia, los Minions ya han huido y van de camino a salvar a Gru.

Los 6 Viciosos rastrean la casa de Gru y arrancan el tejado, interrogando a Marlena y a los demás Minions sobre su paradero. Uno de los Minions les dice que Gru ha sido secuestrado por Knuckles. Los 6 se dirigen entonces a la casa de Knuckles y también arrancan el techo, destrozando el lugar y sin encontrar nada.

Cuando Gru y Knuckles regresan, encuentran su casa destruida. Sabe que han sido los 6 los que han hecho esto, y se enfada porque sigan intentando hacerle daño después de todo este tiempo. Le dice a Gru que se rinde y éste le dice que se vaya a casa, a pesar de las protestas de Gru.

En el centro de la ciudad, se celebra un desfile del Año Nuevo Chino. Otto acaba corriendo entre la multitud. Gru lo ve desde el carrito y corre tras él. Otto le muestra a Gru la Piedra, y éste expresa su orgullo por Otto. Por desgracia, los 6 Viciosos les han alcanzado y capturan a Gru. Justo cuando son acorralados por la Liga Antivillana, Belle coge la Piedra y utiliza sus poderes para convertirla a ella y al equipo en monstruos animales gigantes. Belle se convierte en un dragón que escupe fuego, Strong Hold en un toro, Nun-Chuck en una serpiente, Svengeance en un tigre y Jean-Clawed en un enorme mono (con su brazo en forma de pinza de langosta). Agarran a Gru y lo atan a las manecillas de una torre de reloj, que lo destrozará lentamente.

Knuckles aparece para salvar a Gru, junto con Kevin, Stuart y Bob. Belle convierte a los tres en (respectivamente) un conejo, un pollo y un carnero. Aunque Knuckles se resiste, Belle lo elimina con su aliento de fuego. Los tres recuerdan las palabras de Chow y dan rienda suelta a sus bestias interiores, y proceden a dar una paliza a los Vicious 6 mutados. Otto libera a Gru y éste se apresura a ayudar a sus amigos. Los tres Minions dominan a los 6, y Gru coge la Piedra, usándola para convertirlos a todos en ratas. La AVL aparece y los detiene. Knuckles resulta herido y también es detenido, aunque le dice a Gru que lo volverá a ver pronto.

Corte a un funeral, donde parece que Knuckles ha muerto. Gru le hace un emotivo elogio, pero descubre que Knuckles ha fingido su muerte y se ha escondido. Después de que los Minions interpreten la canción "You Can't Always Get What You Want". Gru se reúne con su ídolo y se alejan hacia el atardecer con el resto de los Minions.

Durante los créditos, Gru lleva a los Minions recontratados a la tienda Criminal Records, que parece estar cerrando. Gru le pregunta al Dr. Nefario si quiere trabajar oficialmente para él y construir artilugios, pero Nefario dice que va a dejar el negocio de los villanos. Gru y los Minions lo convencen con sus ojos de cachorro, y le muestra a Gru una sorpresa: el coche cohete con el que se ve a Gru de adulto. Juntos, el nuevo equipo de villanos se lanza a realizar más actos despreciables.