La película comienza donde lo dejó RE4, con Alice (Milla Jovovich) en un barco lleno de supervivientes zombis que es atacado por las tropas de la corporación Umbrella, dirigidas por una Jill Valentine (Sienna Guillory) a la que le han lavado el cerebro. Alice es expulsada del barco por una explosión y se despierta en una celda de Umbrella en un lugar secreto. También se muestran escenas de Milla Jovovich como ama de casa, casada con Oded Fehr (actor que interpretó a Carlos en la 2 y la 3) y con una hija hipoacúsica, Becky, cuando un brote zombi golpea su casa de los suburbios. Milla y la hija intentan escapar con la ayuda de una mujer local interpretada por Michelle Rodríguez.

De vuelta a la prisión, Alice es liberada por Ada Wong (Bingbing Li) que trabaja para Wesker (Shawn Roberts). Su objetivo es escapar de la prisión subacuática dirigida por la Reina Roja con la ayuda de un equipo que baja de la superficie y que incluye a Luther West de RE4. Ada y Alice luchan a través de centros de pruebas virales donde la Reina Roja libera peligros biológicos en forma de monstruos de películas anteriores. Al llegar a los suburbios, se revela que, para probar adecuadamente las reacciones virales y humanas, la Reina Roja ha estado llenando los centros de pruebas con clones de varios personajes a los que se les imprimen falsos recuerdos y luego se les suelta. El anterior clon de ama de casa de Milla está muerto, pero Alice rescata a la hija antes de reunirse con Jill Valentine y el equipo de seguridad formado por personas de anteriores películas de RE. Ada envía a Alice y a Becky mientras lucha contra el equipo de seguridad. Alice y Becky se reúnen con un clon de Michelle Rodríguez aterrorizado que vigila a Becky mientras Alice busca ayuda.

Mientras tanto, el equipo exterior queda atrapado en una simulación de Moscú hasta que Alice aparece y rescata a los miembros supervivientes. Reclaman a Becky y Michelle y reanudan la lucha para llegar a un ascensor de escape tratando de vencer una bomba preparada para destruir las instalaciones. El equipo de seguridad aparece con Ada como rehén. Además, aparece un supermonstruo anterior. En el subsiguiente tiroteo, la mayoría de los personajes mueren con Alice, la hija, y 2 del equipo de rescate escapando en el ascensor.

Una vez en la superficie, aparecen Jill, el clon de Rain (Michelle Rodríguez) y Ada, que han escapado en un submarino. Milla lucha contra Jill y Rain, que se ha inyectado un supervirus. Milla consigue quitarle el dispositivo de control mental a Jill, que luego la ayuda a derrotar a Rain (que ha matado a Luther durante la pelea) disparando el hielo que hay debajo de ella y haciéndola caer al agua llena de zombis. Los helicópteros rescatan a los supervivientes, que son llevados a reunirse con Wesker en un DC apocalíptico y se les dice que la Reina Roja está intentando acabar con la humanidad. Wesker declara que Alice es la última esperanza de la humanidad y le inyecta el virus t antes de que la cámara se desplace para mostrar todo el complejo rodeado por un ejército de zombis, incluyendo lo que parecen ser dragones zombis.