Peter Parker planea pedirle matrimonio a Mary Jane Watson, que acaba de debutar en un musical de Broadway. Mientras los dos miran las estrellas en Central Park, un meteorito aterriza cerca y un simbionte extraterrestre sigue a Peter hasta su apartamento enganchándose a su moto. Harry Osborn, al saber que Peter es Spider-Man, intenta vengar la muerte de su padre. Utilizando la tecnología del Duende Verde, el gas que mejora el rendimiento de su padre, se enfrenta a Peter, quedando finalmente noqueado y desarrollando una amnesia parcial. Mientras tanto, la policía persigue al convicto fugado Flint Marko, que visita a su mujer y a su hija enferma antes de huir de nuevo. Al caer en un acelerador de partículas experimental que fusiona su cuerpo con la arena circundante, adquiere la capacidad de controlar la arena y reformar su cuerpo con ella, convirtiéndose en Sandman.

Durante un festival, en el que se honra a Spider-Man por haber salvado la vida de Gwen Stacy, Peter la besa para complacer a la multitud, enfadando a Mary Jane. Simultáneamente, Marko roba un camión blindado y escapa tras derrotar fácilmente a Spider-Man. El capitán de la policía de Nueva York George Stacy, padre de Gwen, informa a Peter y a su tía May de que Marko es el verdadero asesino del tío Ben; el fallecido Dennis Carradine era el cómplice de Marko. En su apartamento, mientras Peter duerme con su traje de Spiderman a la espera de que Marko salga de su escondite, el simbionte asimila el traje. Más tarde, Peter se despierta en lo alto de un edificio, descubriendo que el simbionte ha coloreado su traje de negro y ha mejorado sus poderes; sin embargo, también saca a relucir su personalidad más oscura.

Spider-Man localiza y lucha contra Marko en un túnel del metro. Al descubrir que el agua es la debilidad de Marko, abre una tubería, liberando agua que reduce a Marko a barro y lo arrastra. El cambio de comportamiento de Peter aleja a Mary Jane, que está luchando en su carrera debido a que su espectáculo está recibiendo críticas negativas de los críticos. Ella comparte un momento tierno con Harry pero se marcha arrepentida. Urgido por una alucinación de su padre, Harry se recupera de su amnesia y obliga a Mary Jane a romper con Peter. Después de que Mary Jane le diga a Peter que ama a "otra persona", Harry se reúne con Peter y afirma ser esa persona. Bajo la influencia del simbionte, Peter se enfrenta más tarde a Harry por esto y, tras una breve pelea, le dice rencorosamente que su padre nunca le quiso. Cuando Peter se marcha, Harry le lanza una calabaza bomba, que desvía, desfigurando la cara de Harry.

En el Daily Bugle, Peter desenmascara al fotógrafo rival Eddie Brock, cuyas fotos falsas presentan a Spider-Man como un criminal. El editor J. Jonah Jameson despide a Brock y asciende a Peter a fotógrafo de plantilla. Más tarde, Peter lleva a Gwen a un club de jazz, donde ahora trabaja Mary Jane. Peter baila apasionadamente con Gwen delante de Mary Jane, para ponerla celosa. Gwen, al darse cuenta, se disculpa con Mary Jane y se va. Tras agredir a los porteros y golpear accidentalmente a Mary Jane, Peter se da cuenta finalmente de que el simbionte le está corrompiendo. Retirándose al campanario de una iglesia, y dándose cuenta de que los sonidos agudos del metal chocante debilitan a la criatura, Peter se quita el simbionte. Sin embargo, Brock, que se encuentra en la misma iglesia, le sigue y se convierte en el nuevo huésped del simbionte.

Como Venom, Brock localiza a un Marko aún vivo y lo convence de que se una a las fuerzas para matar a Spider-Man. Brock secuestra a Mary Jane y la mantiene cautiva desde lo alto de una telaraña en una obra de construcción, con la intención de matarla en venganza por haber arruinado a Peter, mientras Marko mantiene a la policía a raya. Después de que Harry se niegue a ayudar a Peter, el mayordomo de Harry finalmente le revela la verdad sobre el cadáver de Norman, lo que le hace comprender que no fue culpa de Peter. Mientras Brock y Marko inmovilizan a Peter, Harry llega con su tecnología del Duende Verde para ayudar a Peter y salvar a Mary Jane. Brock intenta empalar a Peter con el planeador de Harry, pero éste salta y es empalado él mismo. Peter, recordando la debilidad del simbionte, monta un perímetro de tubos metálicos para crear un ataque sónico, debilitándolo y permitiendo a Peter separar a Brock del simbionte.

Peter activa una bomba calabaza del planeador de Harry y la lanza al simbionte, ahora sin huésped. Brock, que se ha vuelto adicto a su influencia, intenta salvar al simbionte, y ambos acaban vaporizados. Marko explica entonces que la muerte de Ben fue un accidente que le persigue desde entonces y que todo lo que ha hecho ha sido para intentar ayudar a su hija; Peter perdona a Marko, permitiéndole escapar. Harry y Peter se reconcilian antes de que el primero muera a causa de sus heridas. Un tiempo después del funeral de Harry, Peter visita a Mary Jane en el club de jazz donde trabaja. Se abrazan y comparten un baile.