Hace 65 millones de años, un meteorito se estrella contra la Tierra, matando a los dinosaurios y dividiendo el universo en dos dimensiones paralelas. Los dinosaurios supervivientes cruzan a una nueva dimensión, evolucionando hacia una raza humanoide y fundando la ciudad de Dinohattan.

En 1973, una misteriosa mujer deja un gran huevo, junto con una roca, en un orfanato católico. Cuando intenta marcharse, el Rey Koopa la aborda, exigiendo la ubicación de la roca. Las rocas caen entonces sobre la mujer, matándola. El huevo eclosiona y contiene una niña.

20 años más tarde, los hermanos Mario y Luigi Mario, fontaneros italoamericanos, viven en Brooklyn (Nueva York), a punto de ser expulsados del negocio por la empresa de construcción Scapelli, dirigida por Anthony Scapelli y dirigida por la mafia. Luigi se enamora de Daisy, una estudiante de la Universidad de Nueva York, que está excavando bajo el puente de Brooklyn en busca de huesos de dinosaurio. Después de una cita, Daisy devuelve a Luigi al puente y es testigo de cómo dos de los hombres de Scapelli lo sabotean dejando las tuberías de agua abiertas. Mario y Luigi lo arreglan, pero Iggy y Spike, esbirros y primos de Koopa, los dejan inconscientes y secuestran a Daisy. Al despertar, los hermanos los persiguen a través de un portal interdimensional hasta Dinohattan.

Iggy y Spike se dan cuenta de que han olvidado la roca de Daisy, un fragmento de meteorito que Koopa quiere obtener para fusionar su mundo con el de los humanos. Daisy resulta ser la princesa perdida de la otra dimensión. Cuando Koopa derrocó al padre de Daisy como rey y lo convirtió en hongo, su madre la reina se la llevó a Brooklyn. El portal fue entonces sellado, pero los hombres de Scapelli volvieron a abrirlo sin querer cuando volaron la cueva. Koopa envía a sus primos a buscar a Daisy y la roca para fusionar las dimensiones y convertirlo en dictador de ambos mundos. Sin embargo, después de que Koopa los someta a un experimento para aumentar su inteligencia, se dan cuenta de las malas intenciones de Koopa y se ponen del lado de los Mario Bros. Daisy es llevada a la Torre Koopa, donde conoce a Yoshi. Koopa informa a Daisy de que desciende de los dinosaurios y cree que solo ella puede fusionar los mundos debido a su herencia real. Los Mario Bros. rescatan a Daisy, ayudados por Toad, un guitarrista bonachón que fue convertido en un Goomba, un dinosaurio semi-humanoide, como castigo por una protesta.

Lena, la novia de Koopa, fusiona los dos mundos, aunque la energía del meteorito la mata. Koopa convierte a Scapelli en un chimpancé antes de ir a por Mario, pero Luigi y Daisy extraen el fragmento del meteorito y los mundos vuelven a separarse. En Dinohattan, Mario y Luigi disparan armas de devolución a Koopa y lo fulminan con un Bob-omb. Koopa, ahora convertido en un feroz tiranosaurio semi-humanoide, intenta matar a los Mario Bros., que lo destruyen definitivamente devolviéndolo a un tiranosaurio rex real, y luego a un limo primitivo. El padre de Daisy es restaurado como rey, y los ciudadanos lo celebran e inmediatamente destruyen todo lo que se parezca a Koopa. Luigi le profesa su amor a Daisy y quiere que vaya a Brooklyn con él, pero Daisy, habiendo encontrado tanto su hogar como a su padre, decide quedarse en Dinohattan. Cabizbajo, Luigi se despide de Daisy con un beso mientras él y Mario regresan a su casa en Brooklyn. Tres semanas después, los Mario Bros. se preparan para cenar cuando su historia aparece en las noticias y el presentador dice que deberían llamarse los "Super Mario Bros". Entonces llega Daisy y pide a los Mario Bros. que la ayuden en una nueva misión.

En una escena posterior a los créditos, dos ejecutivos japoneses proponen hacer un videojuego basado en Iggy y Spike, ahora en la Tierra, que se llamará Los Primos Super Koopa.