La historia está ambientada entre finales de los años 20 y principios de los 30 en la ciudad de Toledo. Tristana es una joven que, tras la muerte de su madre, pasa a estar bajo la tutela del conocido noble don Lope Garrido. A pesar de su avanzada edad, Don Lope se niega a cambiar su estilo de vida de playboy, al tiempo que mantiene actitudes fuertes pero cada vez más anticuadas sobre el honor, la caballerosidad y las mujeres. Afirmando que defiende a los débiles de las instituciones corruptas (al tiempo que expresa su apoyo a la política de izquierdas), Don Lope, sin embargo, se ceba con su nueva pupila, embelesado por su belleza e inocencia. Así, la trata como esposa y como hija desde los 19 años, sin que el mundo exterior lo sepa.

Aunque al principio Tristana acepta el acuerdo, a los 21 años empieza a encontrar su voz, a exigir estudiar música, arte y otras materias con las que desea independizarse, irritando a Don Lope, que piensa que las mujeres no son dignas de confianza y deben quedarse en casa. Mientras se escapa de la casa en contra de los deseos de Lope, conoce a Horacio, un joven artista catalán. Los dos se enamoran y Horacio le pide que vaya a vivir con él a Barcelona, pero ella sigue recelosa por la ineludible presencia del Don. Horacio se enfrenta a Don Lope fuera de su apartamento, Lope le abofetea y le reta a un duelo, y Hoarcio responde simplemente dándole un puñetazo en la cara. Él y Tristana se marchan al día siguiente.

Cinco años más tarde, Tristana regresa, habiendo caído repentinamente enferma. Exige que la lleven a la casa de Don Lope para morir allí. Tristana sobrevive, pero pierde una pierna en el proceso, lo que cambia sus perspectivas. Rompe con Horacio y parece retomar la relación anterior con Don Lope, pero ahora es mucho más independiente y abiertamente desafiante. Don Lope, cuyos problemas de salud no han hecho más que empeorar, hereda de repente un dinero de su hermana, que Tristana codicia. Acepta tener un matrimonio de conveniencia con Lope para, como describe un sacerdote local, "corregir una situación previamente pecaminosa", pero deja claro que no tiene ningún deseo de tener una relación romántica o sexual, aceptando al hijo sordomudo de la criada, Saturno, como amante.

Una noche, Lope sufre un infarto en la cama. Tristana finge pedir ayuda hasta que cae inconsciente, y acaba con él abriendo la ventana al frío invernal. La película termina con un montaje de escenas que se reproducen en sentido inverso, terminando en el momento en que Don Lope seduce por primera vez a Tristana.