En 1989, Kevin Flynn, que fue ascendido a director general de ENCOM International al final de la primera película, desaparece. Veinte años más tarde, su hijo Sam, que ahora es el principal accionista de ENCOM, hace una broma a la corporación publicando gratuitamente en Internet el sistema operativo característico de la empresa. El ejecutivo de ENCOM, Alan Bradley, viejo amigo de Flynn, lo aprueba, creyendo que se alinea con los ideales de Flynn sobre el software abierto. Sin embargo, Sam es arrestado por allanamiento de morada.

Alan paga la fianza de Sam y le habla de un mensaje de buscapersonas procedente de la clausurada sala de videojuegos de Flynn. Allí Sam descubre un sótano oculto con un gran ordenador y un láser, que de repente lo digitaliza y lo descarga en la Red, una realidad virtual creada por Flynn. Es capturado y enviado a "los Juegos", donde debe luchar contra un programa enmascarado llamado Rinzler. Cuando Sam es herido y sangra, Rinzler se da cuenta de que Sam es humano, o un "Usuario". Lleva a Sam ante Clu, el programa gobernante corrupto de la Red, que se parece a un joven Kevin.

Clu casi mata a Sam en un combate de Ciclo de Luz, pero Sam es rescatado por Quorra, una "aprendiz" de Flynn, que le muestra el escondite de Flynn fuera del territorio de Clu. Flynn le explica que ha estado trabajando para crear un sistema informático "perfecto", y que ha designado a Clu y al programa de seguridad Tron como sus cocreadores. El trío descubrió una especie de "algoritmos isomórficos" (ISO) de origen natural, con el potencial de resolver varios misterios naturales. Clu, considerándolos una aberración, traicionó a Flynn, mató a Tron y destruyó los ISO. El "Portal" que permitía viajar entre los dos mundos se cerró, dejando a Flynn atrapado en el sistema. Clu envió el mensaje a Alan para atraer a Sam a la Red y reabrir el Portal por un tiempo limitado. Dado que el "disco de identidad" de Flynn es la llave maestra de la Red y la única forma de atravesar el Portal, Clu espera que Sam lleve a Flynn al Portal para poder tomar el disco de Flynn, atravesar el Portal él mismo e imponer su idea de perfección en el mundo humano.

En contra de los deseos de su padre, Sam regresa al territorio de Clu para encontrar a Zuse, un programa que puede proporcionar un paso seguro al Portal. En el End of Line Club, el propietario se revela como Zuse, y luego traiciona a Sam ante los guardias de Clu. En la pelea resultante, Flynn rescata a su hijo, pero Quorra resulta herida y Zuse se hace con el disco de Flynn. Zuse intenta negociar con Clu por el disco, pero Clu simplemente lo toma y destruye el club junto con Zuse. Flynn y Sam viajan de polizón a bordo de un programa de transporte "Solar Sailer", donde Kevin restaura a Quorra y le revela que es la última ISO superviviente.

El transporte es interceptado por la nave de guerra de Clu. Como distracción, Quorra se deja capturar por Rinzler, a quien Flynn reconoce como Tron, reprogramado por Clu. Sam reclama el disco de Flynn y rescata a Quorra, mientras Flynn toma el control de un Light Fighter. Clu, Rinzler y varios guardias persiguen al trío en los Light Jets. Rinzler recuerda su pasado como Tron y colisiona deliberadamente con el Light Jet de Clu, cayendo después en el Mar de la Simulación. Clu se enfrenta a los otros en el Portal, donde Flynn se reintegra con su duplicado digital, destruyendo a Clu junto con él mismo. Quorra, habiendo intercambiado discos con Flynn, le da el disco de Flynn a Sam y escapan juntos al mundo real mientras la explosión resultante arrasa el Mar de la Simulación. En la sala de juegos de Flynn, Sam retrocede y desactiva el sistema. Luego le dice a un Alan que lo espera que planea retomar el control de ENCOM, nombrando a Alan presidente de la junta. Sam parte en su motocicleta con Quorra, y ella es testigo de su primer amanecer real.